Les échantillons seront analysés par le laboratoire partenaire. Trois étapes doivent être réalisées pour identifier les espèces :

1. Extraction de l’ADN

Cette étape consiste à extraire les molécules d’ADN présentes sur les filtres et écouvillons collectés sur le terrain. Elle permet d’isoler l’ADN environnemental en vue des analyses suivantes.

2. Amplification et séquençage

Cette étape a pour objectif d’amplifier l’ADN par des réactions de PCR, en ciblant spécifiquement un ou des groupe(s) d’espèces grâce à un choix de marqueurs. L’amplification permet d’obtenir un nombre suffisant de fragments d’ADN pour les analyses ultérieures.

Exemples de marqueurs couramment ciblés pour l’amplification :

  • CO1 pour l’ensemble des vertébrés

  • 12S pour les mammifères

  • …

Le séquençage consiste à analyser l’ADN afin d’identifier précisément les séquences d’intérêt présentes dans un échantillon. Généralement cette étape est réalisée à l’aide d’un séquenceur Illumina NovaSeq®.

3.Tri et identification

L’identification des espèces présentes est réalisée en comparant les séquences d’ADN amplifiées avec des bases de données génétiques. Ce processus permet d’associer chaque séquence à une espèce en fonction de la similarité génétique.

Exemples de bases de données couramment utilisées :

  • BOLD Database pour les séquences CO1
  • NCBI GenBank pour les séquences 12S
  • …

À l’issue de cette étape, une liste des espèces potentiellement présentes pour chaque station d’échantillonnage est générée, accompagnée d’un pourcentage de similarité vis-à-vis de la plus proche séquence d’ADN référencée dans la base de données.

Après avoir obtenu la liste des espèces détectées, il est nécessaire de faire un tri a posteriori en écartant les unités taxonomiques opérationnelles (UTO) et les séquences d’ADN de faible qualité (nombre de séquences insuffisant ou faible pourcentage de ressemblance). Pour ce faire des pourcentages seuils sont appliqués en fonction de la précision souhaitée et du marqueur utilisé. Ensuite, la distribution géographique des espèces identifiées est vérifiée pour confirmer leur présence dans la zone d’étude, permettant de ne garder que les espèces pertinentes.